上一篇内容我们讲述了如何使用SlideViewer进行截图，当我们获取了一张组织切片的图像后，需要借助软件量化，以确定某蛋白在组织学层次的表达水平。

使用ImageJ对组化结果进行分析的经验总结

（2024.9.27）

1. ImageJ软件与IHC Profiler插件的安装

1.1 ImageJ下载与安装

1.2 IHC Profiler插件安装

  • 插件下载链接：https://sourceforge.net/projects/ihcprofiler

  • 插件安装步骤：

    1. 将IHC Profiler文件夹放入ImageJ的Plugins目录。

    2. 重启ImageJ。

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      img

  • 宏安装步骤：

    1. 将IHC_Profiler.txt文件放入ImageJ的macros文件夹。

    2. 点击菜单栏：Plugins > Macros > Install，选择该宏文件。
      【注意：每次使用前需按照下图步骤重新安装插件，否则结果可能误差出现极大！！】

    img

    然后点击****Plugins -> Macros -> Install****，选择该txt文件，即可在Plugins -> Macros中找到该宏：

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2. 组化分析准备工作

2.1 常见评分方法

  1. 积分法（赋分法）

    • 灰度值划分：

      • High positive (0-60)：赋4分
      • Positive (61-120)：赋3分
      • Low Positive (121-180)：赋2分
      • Negative (181-236)：赋1分
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  2. 平均光密度法

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  1. 阳性细胞计数法

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3. 操作步骤详解

3.1 胞浆染色分析

  1. 打开ImageJ，安装IHC Profiler宏（每次使用前需重复）。

  2. 点击File > Open，加载胞浆染色图片。

  3. 点击菜单栏：Plugins > IHC Profiler。

  4. 选择Cytoplasmic Staining（胞浆染色）模式，勾选H DAB（与DAB显色相关），点击OK（参考文档中图12-图15）。

  5. 获取评分结果，关闭无关弹窗（如Histogram）。

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    选择H DAB点击OK【该步骤与免疫组化种DAB显色步骤有关】img

    得到评分结果如图：

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    【在实际操作过程中，不只会出现Log对话框，还有Histogram等，但并不是我们需要的，关闭即可】

    img

    【注意不是*Plugins > IHC profiler，否则会得到*img****这样的报错警告****】

3.2 胞核染色分析

  1. 打开ImageJ，安装IHC Profiler宏。

  2. 点击File > Open，加载胞核染色图片。

  3. 点击菜单栏：Plugins > IHC Profiler。

  4. 选择Nuclear Staining（胞核染色）模式，勾选H DAB（无需手动设置阈值）。

  5. 点击Plugins > Macros > IHC Profiler获取结果（避免直接点击Plugins > IHC Profiler，否则可能报错，参考文档中图19）。

    img

选择核染色mode，勾选H DAB得到如下界面：

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4. 批量处理：使用宏简化分析

4.1 录制宏

  1. 点击Plugins > Macros > Record，按胞浆染色步骤操作。
  2. 保存生成的宏指令（示例指令：run("IHC Profiler", "mode=[Cytoplasmic Stained Image] vectors=[H DAB]");）。

4.2 批量运行

  1. 点击Process > Batch > Macro。
  2. 输入宏指令，设置输入/输出文件夹路径。
    注意：
    • 仅支持单层文件夹，需逐个分析不同指标切片。
    • 输出Log文件包含所有评分结果。

我们知道，组化图像的分析往往百张起步，每一张图片都经历以上步骤将耗费大量的时间，且容易错误，所以笔者摸索了如下技巧，可供参考！

首先，将待分析的文件保存在一个位置，确定其文件路径：

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右键点击“属性”即可知道文件路径，而后在imageJ中点击Plugins > Macros > Record

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得到如下界面：

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*此时按照所需步骤操作，得到如下指令：*

img img

*得到如下界面*

img

*将指令拷贝进入运行框，将待分析的文件路径拷贝如INPUT，将OUTPUT设置成另一个文件夹。*

*【该方法原本是用于简化大批量图片处理的过程，所以输出的是图片，但我们需要的是Log，所以图片的输出位置和格式没有要求】*

*之后，我们便可以在一个log中直接得到多张图片的分析结果，直接将其保存入对应的文件夹即可。*

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#赋分法
run("IHC Profiler", "mode=[Cytoplasmic Stained Image] vectors=[H DAB]")

#AOD
run("8-bit");
run("Calibrate...", "function=[Uncalibrated OD] unit=[Uncalibrated OD] text1= text2= show");
setAutoThreshold("Default");
//run("Threshold...");
resetThreshold;
setAutoThreshold("Default");
setThreshold(0, 125, "raw");
run("Set Measurements...", "area integrated limit display redirect=None decimal=3");
run("Measure");

#阳性占比
run("RGB Stack");
setSlice(3);  
setAutoThreshold("Default");
//run("Threshold...");
setAutoThreshold("Default");
setThreshold(0, 125, "raw");
run("Set Measurements...", "area mean integrated area_fraction limit display redirect=None decimal=3");
run("Measure");

#请手动调整阈值

5. 数据录入与整理

  1. 将Log文件中的评分结果录入Excel表格。
  2. 技巧：使用手机文字识别功能（如微信传输助手）提高录入效率。
  3. 计算IHC Score，分析蛋白表达差异。

6. 注意事项

  1. 插件兼容性：确保每次分析前重新安装宏。
  2. 文件管理：批量处理时避免嵌套文件夹。
  3. 结果验证：手动抽查部分结果，确保准确性。