免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种通过抗原-抗体特异性结合原理，在组织切片中定位目标蛋白的技术。

以下是其基本步骤及关键要点：

1. 样本制备

  • 取材与固定

    • 快速取新鲜组织，切成适当大小（通常≤5mm厚）。
    • 立即浸泡于固定液（如4%中性缓冲甲醛）中，固定时间依组织类型而定（通常6-24小时）。
    • 目的：保持组织形态，防止抗原降解。

  • 脱水与包埋

    • 梯度酒精脱水（70%~100%乙醇），二甲苯透明，浸蜡包埋成蜡块。
    • 注意：过度脱水可能破坏抗原表位。

2. 切片与贴片

  • 切片

    • 用切片机将蜡块切成3-5μm薄片，贴附于防脱载玻片上。
    • 关键：避免切片折叠或破损。

  • 烤片

    • 60-65℃烘箱中烤片1-2小时，增强组织与玻片粘附性。

3. 脱蜡与水化

  • 脱蜡
    • 二甲苯浸泡（2次×10分钟），去除石蜡。
  • 水化
    • 梯度酒精（100%→95%→80%→70%→50%→水）逐步复水至PBS。
    • 目的：恢复组织含水状态，便于后续反应。

4. 抗原修复

  • 必要性
    • 甲醛固定可能遮蔽抗原表位，需通过修复暴露。
  • 方法
    • 热修复（常用）：将切片浸入抗原修复液（如pH 6.0柠檬酸盐缓冲液或pH 9.0 EDTA缓冲液），微波或高压加热至沸腾，维持10-20分钟。
    • 酶消化：使用蛋白酶K或胰酶处理（适用于某些特定抗原）。
  • 冷却：室温自然冷却至30℃以下，避免热损伤组织。

5. 阻断内源性干扰

  • 内源性过氧化物酶阻断
    • 3% H₂O₂溶液处理10-20分钟（针对HRP标记系统）。
  • 内源性生物素阻断
    • 使用生物素阻断剂（如Avidin/Biotin Blocking Kit）。
  • 目的：减少假阳性背景信号。

6. 封闭

  • 封闭液
    • 5-10%正常血清（与二抗来源相同，如羊血清）或BSA，室温封闭30-60分钟。
  • 目的：阻断非特异性结合位点，降低背景染色。

7. 一抗孵育

  • 一抗选择
    • 根据目标蛋白选择特异性抗体，稀释于抗体稀释液（含1% BSA的PBS）。
  • 孵育条件
    • 湿盒中4℃过夜（常用），或室温孵育1-2小时（快速法）。
  • 关键
    • 优化抗体浓度和孵育时间（需预实验确定）。

8. 洗涤

  • 洗涤液
    • 用PBS或TBS（含0.05% Tween-20）清洗，3次×5分钟。
  • 目的：去除未结合的一抗，减少非特异性吸附。

9. 二抗孵育

  • 二抗选择
    • 根据一抗种属选择HRP或AP标记的二抗（如抗兔-HRP）。
  • 孵育条件
    • 室温避光孵育30-60分钟，避免长时间孵育导致背景升高。

10. 显色与复染

  • 显色

    • HRP系统：DAB显色液（棕褐色）→显微镜下控制显色时间（通常1-10分钟）。
    • AP系统：BCIP/NBT显色液（蓝紫色）。

  • 终止

    • 显色完成后立即用蒸馏水或PBS终止反应。

  • 复染

    • 苏木素复染细胞核（1-5分钟），盐酸酒精分化，返蓝液处理。
    • 目的：增强组织结构的对比度。

11. 脱水与封片

  • 脱水
    • 梯度酒精脱水（低浓度→高浓度），二甲苯透明。
  • 封片
    • 中性树胶封片，避免气泡。

12. 结果观察与保存

  • 显微镜观察
    • 光学显微镜下分析目标蛋白定位及表达强度。
  • 保存
    • 避光保存切片，防止褪色。

关键注意事项

  1. 全程防干：任何步骤中组织切片不可干燥，否则易产生非特异性背景。
  2. 缓冲液选择：始终使用PBS或TBS（pH 7.2-7.6），避免清水破坏抗原或抗体活性。
  3. 对照设置：
    • 阴性对照（不加一抗或同型IgG）。
    • 阳性对照（已知表达目标蛋白的组织）。
  4. 优化条件：抗体浓度、修复方法、显色时间需根据实验体系调整。