细胞实验（一）基本操作
以下是悬浮细胞（如淋巴细胞、某些肿瘤细胞系）的 复苏、传代、换液、冻存 基本操作步骤及注意事项：
一、细胞复苏
目的
快速恢复冻存细胞的活性。
步骤
准备
- 预热完全培养基至37℃，离心机预冷至4℃。
- 水浴锅预热至37℃。
解冻
- 从液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水浴，轻轻摇晃至完全解冻（约1-2分钟）。
清洗
- 将细胞悬液转移至15ml离心管，加入5ml预冷的完全培养基（中和DMSO毒性）。
- 4℃、200×g离心5分钟（即低速离心机1000rpm），弃上清。
重悬与接种
- 用适量完全培养基轻柔重悬细胞，计数后接种至培养瓶/皿。
- 放入37℃、5% CO₂培养箱，24小时后观察细胞状态。
注意事项
- 操作迅速，避免反复冻融。
- 初次复苏建议培养基中加1-2倍双抗（防止污染）。
二、细胞传代
目的
维持细胞生长密度，防止过度堆积。
步骤
收集细胞
- 轻摇培养瓶使细胞均匀悬浮，将细胞悬液转移至离心管。
- 室温、200×g离心5分钟，弃上清。
计数与稀释
- 用完全培养基重悬细胞，按比例稀释（如1:3或1:4）。
- 接种至新培养瓶，补足培养基（根据细胞类型调整密度）。
培养
- 放回培养箱，定期观察细胞增殖状态（通常2-3天传代一次）。
注意事项
- 离心速度不宜过高（避免机械损伤）。
- 传代密度需优化（过高易聚集，过低生长缓慢）。
三、细胞换液
目的
清除代谢废物，补充营养。
步骤
离心
- 将细胞悬液转移至离心管，室温、200×g离心5分钟，弃上清。
换液
- 用预热的完全培养基重悬细胞，接种回原培养瓶或新瓶。
注意事项
- 若细胞状态良好，可直接补充新鲜培养基（无需离心）。
- 换液频率根据细胞代谢速度调整（通常2-3天一次）。
四、细胞冻存
目的
长期保存细胞活性。
步骤
准备冻存液
- 配方：完全培养基 + 10% DMSO + 20% FBS（或商品化冻存液，可以直接冻存在-80℃，不用梯度降温）。
- 预冷至4℃。
收集细胞
- 取对数生长期细胞，离心后弃上清，用冻存液重悬至1-5×10⁶ cells/ml。
分装
- 将细胞悬液分装至冻存管（每管1-1.5ml），标记名称、日期、代数。
程序降温
- 冻存盒法：4℃ 30分钟 → -20℃ 2小时 → -80℃过夜 → 转移至液氮。
- 或使用程序降温仪（每分钟降1℃至-80℃）。
注意事项
- DMSO对细胞有毒，操作需快速。
- 冻存前检测细胞活力（>90%为宜）。
关键通用原则
- 无菌操作：全程超净台内完成，避免污染。
- 轻柔操作：吹打、离心时避免机械损伤。
- 记录信息：冻存/复苏时记录细胞代数、日期、培养基批次。
- 质量控制：定期检测支原体污染及细胞活性。
常见问题处理
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 复苏后细胞死亡率高 | 解冻速度慢/DMSO残留 | 快速解冻，彻底清洗冻存液 |
| 传代后细胞不增殖 | 密度过低/培养基失效 | 调整接种密度，更换新鲜培养基 |
| 冻存后无法复苏 | 降温速率不当/液氮泄漏 | 检查冻存程序，确保液氮储存 |
【细胞状态佳，密度均匀，边界清晰、透亮、光滑】
【细胞污染】
【细胞结成团块】
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