要点

1、标本固定：

固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。

2、脱水、石蜡包埋和制片：

脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。

【如果一块石蜡包埋了两个结构normal—tumor，要注意切片时两方都切到】

3、脱蜡和水化：

这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

【烤片时间与切片的新旧程度也相关，如果刚包埋刚切出的片烤的时间也可以适量减少】

4、抗原修复：

由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。

注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。

5、细胞通透：

目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。

6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：

在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。

7、血清封闭：

组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温或37度10-30min。

8、一抗和二抗浓度和孵育时间：

一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。

一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；

孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。

二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

9、抗体稀释液：

其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。

10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：

为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min3次，而一抗孵育后的清洗均为5次5min。

注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。

这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。

（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

11、DAB显色：

背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

12、复染：

目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。

盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

13、封片：

为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

DAB即二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine），辣根过氧化物酶（Peroxidase）最常用的生色底物，其显色原理是在过氧化氢的作用下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕色不溶性产物，该反应灵敏度高、特异性好，常用于免疫组化、原位杂交、Western Blot等膜显色或检测细胞或组织内源性的过氧化物酶。由于生成的显色产物不溶于乙醇，因此，在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。可配合DAB染色使用的复染方法包括亚甲基蓝、甲基绿和苏木精。DAB，也称硒试剂，可用于分光光度法检测硒含量。而加SABC的前一步是加二抗，SABC里的链霉亲和素可以和二抗结合，起到一个抗原信号放大的效应

l 内源性酶的灭活

免疫组化技术多数是用过氧化酶或碱性磷酸酶进行标记抗体或抗原，但由于自身组织内也有过氧化酶(内源性酶)存在，这些内源性酶也能崔化底物着色从而产生非特异性导致假阳性。因此第一步用3％过氧化氢室温下浸泡组织片15 min把组织内的内源性酶进行灭活处理，从而减少因此产生的非特异结果。

2酶消化及抗原收复液

在组织的防腐固定中，通常使用醛与组织的蛋白结合使组织蛋白变性，从而达到防腐作用，但同时也封闭了抗原决定簇，降低了抗体和抗原决定簇的结合反应。在实际操作过程中我们可以用胰酶和抗原收复液重新恢复抗原的活性，暴露抗原决定簇使之与抗体充分结合。胰酶主要是收复和暴露细胞浆内的抗原决定簇，容易穿透胞膜发生作用，故不需高温操作，一般是在37℃ 水浴箱内放置15 min就可以达到满意的效果；但抗原收复液主要是收复胞核内的抗原决定簇，在高温(95℃)才能透达胞核使核内的弱抗原暴露，因此在实际操作中，我们用微波中火档9 min，每3min停留5min

3血清封闭

使得核内决定簇有足够时间充分地暴露· 非特异性染色最常见的原因是蛋白吸附于高电荷胶原和结缔组织成分上。最有效去除方法是在第一抗体加入前制备与第一抗体相同动物的非免疫血清，封闭组织上带电荷基因使抗原与胶原和结缔组织游离，从而去除第一抗体非特异性结合。一般情况下加入正常山羊血清或牛血清，37℃水浴箱封闭20

4防止阴性对照的阳性出现

磷酸盐缓冲液(PBS)阴性对照出现阳性结果，这肯定是假阳性，造成这一假阳性的原因有多种，其中一种是暴露的内源性氧化酶后使用血清封闭不完全，因此在血清封闭时一定要在37。C 水浴箱封闭20 min；另一种是与加入一抗后的载玻片放于同一有机玻璃盒内进行孵育，在同一孵育盒内抗体蒸发后污染PBS阴性对照组的组织片，导致阳性结果的出现，因此阴性对照组必须与阳性组完全独立操作，在独立的孵育箱内进行孵育，另外在漂洗过程中不能与阳性组混为一体，所有程序都应保持独立，独自漂洗、孵育，防止受抗体的污染而出现阳性结果。

5抗体浓度

抗体浓度不能过高，抗体分子多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果，这一现象类似于凝集反应中“前带效应”。对于抗体中非特异性蛋白的只有高稀释度时才能防止其非特异性背景染色，一般抗体浓度为1：600最合适。

6防止组织片干燥

在整个操作流程中都不能让组织片干燥，干燥过后的组织片非常容易出现假阳性，尤其是二甲氨基偶氮苯(DAB)染色过程中，干燥后会导致整个组织一片棕黄色的假阳性出现。在操作过程中当载玻片上水分与组织片一分离就马上加入抗体或其他试剂，这样既保持组织片的湿润又不至于试剂外泄，降低试剂的浓度而影响实验结果。

7背景

若组织片背景色不清晰，可在滴加链霉亲合素一生物素一过氧化物酶连结法(SABC)后用0．02％“吐温”PBS液进行漂洗5 min X5次，能有效地减少非特异性结合而减少背景染色，从而会得到清晰的背景。

8脱水

完全脱干水分后应立即进行封片，尤其是在潮湿天气，组织片容易回潮而影响清晰度。以上操作要点是在多年的工作经验总结而得的，按照以上流程操作定能做出背景清晰，定位准确，阴、阳性对照明显的组织片。